Mikroskopska se pretraga može izvesti brzo, no točnost ovisi o iskustvu mikroskopičara i kvaliteti opreme. Propisi često ograničavaju liječnicima korištenje mikroskopa u dijagnostičke svrhe izvan ovlaštenog laboratorija.
Mikroskopski pregled tkiva može biti potreban za razlikovanje invazivne bolesti od površinske kolonizacije - razlikovanje koje nije jednostavno postići metodama uzgoja u kulturi.
Većina se uzoraka obradi bojom koja oboji uzročnika te se na taj način oni razlikuju od pozadine, premda se za otkrivanje gljiva i određenih drugih patogena mogu koristiti neobojeni vlažni razmazi.
Kliničar bi trebao zatražiti bojenje prema pretpostavljenom najvjerojatnijem uzročniku, no niti jedno bojenje nije 100% specifično. Većina uzoraka boji se po Gramu, i, kod sumnje na mikobakterije, acidorezistentnom bojom. Međutim, neki patogeni nisu lako vidljivi pomoću ovih metoda bojenja; ukoliko se sumnja na takve patogene, potrebne su druge metode bojenja ili drugi identifikacijski testovi.
S obzirom da je za otkrivanje mikroskopom uobičajeno potrebna koncentracija mikroorganizama od najmanje ~1 × 10e4-5/ml, prije pretrage većina se uzoraka tjelesnih tekućina (npr. likvor) koncentrira (npr. centrifugiranjem).
Bojenje po Gramu:
Bojenjem po Gramu postiže se sljedeće:
-
Klasifikacija bakterija prema tome zadržavaju li kristal ljubičastu boju (gram-pozitivne - plava) ili ne (gram-negativne - crvena)
-
Isticanje morfologije stanica (npr. bacili, koki) i stanične organizacije (primjerice nakupine, lanci, diploidi)
-
Identifikacija polimorfonuklearnih leukocita što ukazuje na bakterijsku infekciju, a ne na kolonizaciju
Takve značajke mogu usmjeriti antibiotsko liječenje dok se čeka konačna identifikacija. Pronalazak mješavine mikroorganizama s različitim morfologijama i karakteristikama kod bojenja po Gram-u, upućuje na kontaminiran uzorak ili polimikrobnu bakterijsku infekciju. Pronalaženje brojnih pločastih stanica u uzorku sputuma ukazuje na kontaminaciju uzorka slinom te se takav uzorak ne može dijagnostički interpretirati.
Kako bi obojali uzorak po Gram-u, tehničari toplinski fiksiraju uzorak na stakalce i potom ga boje uzastopnim izlaganjem bojilima: kristalvioletom, kalijevim jodidom, potom ispiranjem alkoholom i konačno kontrastnim bojilom (najčešće safraninom).
Acidorezistentno i modificirano acidorezistentno bojenje
Ove vrsta bojenja koristi se za identifikaciju:
Iako je za otkrivanje mikobakterija u sputumu potrebno najmanje 10.000 organizama/ml, mikobakterije se često u sputumu nalaze u manjoj količini, što čini osjetljivost metode ograničenom. Uobičajeno se nekoliko mililitara sputuma dekontaminira natrijevim hidroksidom i koncentrira centrifugiranjem za acidorezistentno bojenje. Time se postiže bolja specifičnost, premda je neke umjereno acidorezistentne organizme teško razlikovati od mikobakterija.
Fluorescentna bojenja
Ona omogućuju otkrivanje manjih koncentracija (< 1 × 10e4 stanica/mL). Primjeri su
-
Akridinska narančasta (bakterije i gljivice)
-
Auramin - rodamin i auramin O bojenja (mikobakterije)
-
Kalkofluor bijelo bojenje (gljivice, posebno dermatophytes)
Spajanje fluorescentne boje s protutijelom na uzročnika (direktna ili indirektna imunofluorescencija) teoretski bi trebalo povećati osjetljivost i specifičnost. Međutim, tumačenje takvih testova je otežano i mali je broj komercijalno dostupnih testova koji se koriste u svakodnevnoj upotrebi (npr. Pneumocystis i Legionella izravni fluorescentni testovi).
Vlažni (nativni) preparati
Vlažni preparati neobojenih uzoraka mikroskopiranjem u tamnom polju mogu se koristiti za otkrivanje sljedećeg:
-
Gljiva
-
Parazita (uključujući jajašca i ličinke helminta)
-
Karakterističnih stanica poput klupka naziva "clue cells" (prisutnih kod bakterijskih vaginoza)
-
Pokretnih organizama (npr. Trichomonas)
-
Treponema spiroheta (prisutne kod sifilisa)
Vidljivost gljiva može se povećati primjenom 10%-tnog kalijevog hidroksida (KOH) kojim se otapaju okolna tkiva i ne-gljivični organizmi.
Bojenje tušem ("India ink")
Bojenjem tušem se uglavnom koristi za otkrivanje Cryptococcus neoformans i drugih inkapsuliranih gljiva u suspenziji stanica (npr. sedimentu likvora). Ovim se postupkom zapravo boji pozadina, a ne uzročnik, čime se ističe vidljivost neobojene kapsule oko uzročnika koje se vidi kao prosvjetljenje ("halo"). Kod pretrage likvora, bojenje tušem nije tako osjetljivo kao otkrivanje kriptokoknog antigena. Specifičnost je također ograničena; leukociti se mogu činiti inkapsuliranima.
Bojenje po Warthin-Starryju i bojenje po Dieterleu
Ova se bojenja srebrom koriste za vizualizaciju bakterija poput:
Bojenje po Wrightu i Giemsi:
Ova se bojenja koriste za detekciju sljedećeg:
Trikromno bojenje (po Gomori-Wheatleyju) i željezo-hematoksilin bojenje:
Ova se bojenja rabe za otkrivanje crijevnih protozoa.
Bojenje po Gomori-Wheatleyju se rabi za otkrivanje mikrosporidija. Ovim se bojenjem može propustiti vizualizacija jajašaca i larvi helminata, a nije pouzdano niti otkrivanje Cryptosporidiuma. Boju primaju i gljivice i stanice ljudskog tkiva.
Bojenje željezo-hematoksilin različito oboji stanice, stanične inkluzije i jezgre. Bojenjem željezo-hematoksilinom jajašca helminata se mogu obojiti pretamno što onemogućuje identifikaciju.