Molekularna identifikacija nukleinskih kiselina postala je uobičajena u kliničkim uvjetima; dobivena brza identifikacija omogućuje ciljano liječenje pacijenta čime se izbjegava prolongirana upotreba empirijske, potencijalno neadekvatne terapije.
Metodama detekcije nukleinskih kiselina otkrivaju se za mikroorganizam specifične sekvence DNK ili RNK izdvojene iz uzročnika. Sekvence/nizovi mogu i ne moraju biti amplificirani in vitro.
Metode detekcije nukleinskih kiselina općenito su specifične i vrlo osjetljive te se mogu koristiti za sve skupine mikroorganizama. Rezultati su brzo dostupni. Budući da je svaki test tipno specifičan za pojedini mikroorganizam, kliničar mora znati dijagnostičke mogućnosti te shodno njima zatražiti izvođenje određene pretrage. Primjerice, ako pacijent ima simptome koji ukazuju na gripu, ali je sezona gripe završila, korisnije je upotrijebiti općenitiji dijagnostički test na viruse (npr. virusnu kulturu) umjesto specifičnog testa na gripu jer su i drugi virusi (npr. virus parainfluence, adenovirusi) mogući uzročnici.
Nedavni napreci doveli su do razvoja multipleks analiza, u kojima pojedinačni test nukleinske kiseline može otkriti i razlikovati ≥ 2 uzročnika. Multipleks testovi su obično manje osjetljivi od kvalitativne analize s pojedinačnim ciljem. Oni također mogu biti manje specifični; neočekivane pozitivne rezultate koji nisu u skladu s kliničkom slikom pacijenta treba razmotriti s oprezom. Multipleks testovi su trenutno dostupni za otkrivanje agensa biološkog ratovanja.
Metode detekcije nukleinskih kiselina su kvalitativne, ali kvantifikacijske metode postoje za rastući broj infekcija (npr. HIV–om, citomegalovirusom, humanim T–staničnim limfotropnim virusom); ove su metode učinkovite za dijagnozu i praćenje odgovora na terapiju.
Testiranje bez amplifikacije
Tehnike kojima su ciljne sekvencije nukleinskih kiselina, ali nije potrebna njihova amplifikacija ograničene su na situacije u kojima je mikroorganizam isprva uzgojen u kulturi ili se u uzorku nalazi u visokim koncentracijama (npr. kod faringitisa uzrokovanog streptokokom grupe A, genitalnih infekcija uzrokovanih Chlamydijom trachomatis i Neisseriom gonorrhoeae).
Amplifikacija nukleinskih kiselina
Za tehniku amplifikacije (umnožavanja) nukleinskih kiselina potrebna je vrlo mala količina DNK ili RNK koja se potom višestruko replicira, čime se mogu otkriti sićušni tragovi mikroorganizma u uzorku izbjegavajući potrebu uzgoja u kulturi. Ove su metode osobito korisne za otkrivanje mikroorganizama koje je teško uzgojiti ili identificirati pomoću drugih metoda (npr. virusa, obligatnih intracelularnih uzročnika, gljiva, mikobakterija, nekih drugih bakterija) ili koji se nalaze u malom broju.
Ovi testovi mogu uključivati
-
Ciljane amplifikacije (npr. lančana reakcija polimeraze [PCR], PCR reverznom transkriptazom [RT–PCR], amplifikacija pomaka lanca, transkripcijska amplifikacija)
-
Amplifikacija signala (npr. pretrage razgranate DNK, hvatač hibrida)
-
Amplifikacijska proba (npr. lančana reakcija ligaze, upadač–cjepač metoda, ciklične probe)
-
Postamplifikacijska analiza (npr. određivanje nizova amplificiranog produkta, mikromatrična analiza i analiza krivulje taljenja se izvode pomoću PCR–a u realnom vremenu)
Odgovarajuće prikupljanje uzoraka i pohrana prije dolaska u molekularni dijagnostički laboratorij je od kritične važnosti. Budući da je amplifikacijska metoda tako osjetljiva, lako može doći do lažno pozitivnih rezultata zbog zagađenja uzorka ili opreme.
Usprkos velikoj osjetljivosti, ponekad se događaju lažno negativni rezultati, čak i kad bolesnik pokazuje simptome (npr. kod infekcije virusom zapadnog Nila). Lažno negativni rezultati mogu se smanjiti:
-
Izbjegavanjem uporabe drvenih štapića i vrhova od vate prilikom uzimanja briseva (moraju se koristiti brisevi predviđeni za amplifikacijske testove)
-
Žurni transport uzoraka
-
Zamrzavanje ili hlađenje uzoraka ako je pretpostavljena odgoda transporta > 2 h
Zamrzavanje je uobičajena metoda za pohranu uzoraka za testove amplifikacije nukleinskih kiselina. Međutim, uzorke treba čuvati u hladnjaku, a ne zamrznuti kod sumnje na labilne viruse (npr. varicella-zoster virus, virus gripe, HIV-2) ili ako se pretpostavlja da će biti potrebna kultivacija virusa (smrznuti uzorci ne mogu biti iskorišteni za standardnu kultivaciju virusa).